Chambers wurde in Brooklyn, New York, als Sohn von William P. Chambers (1827-1911), einem Unternehmens- und Konkursanwalt, und Caroline Smith Boughton (1842-1913) geboren. Er wurde zunächst am Brooklyn Polytechnic Institute ausgebildet und trat dann im Alter von etwa zwanzig Jahren in die Art Students' League ein, wo der Künstler Charles Dana Gibson ein Mitstudent war. Von 1886 bis 1893 studierte Chambers in Paris an der École des Beaux-Arts und der Académie Julian, und bereits 1889 wurden seine Werke im Salon ausgestellt. Nach seiner Rückkehr nach New York gelang es ihm, seine Illustrationen an die Zeitschriften Life, Truth und Vogue zu verkaufen. Danach widmete er sich aus ungeklärten Gründen dem Schreiben und verfasste 1887 in München seinen ersten Roman In the Quarter. Sein berühmtestes und vielleicht auch verdienstvollstes Werk ist Der König in Gelb, eine Sammlung von Jugendstil-Kurzgeschichten, die 1895 veröffentlicht wurde. Sie enthält mehrere berühmte unheimliche Kurzgeschichten, die durch das Thema eines fiktiven Dramas gleichen Titels verbunden sind, das die Leser in den Wahnsinn treibt. E. F. Bleiler bezeichnete Der König in Gelb als eines der wichtigsten Werke der amerikanischen übernatürlichen Fiktion und wurde auch von H. P. Lovecraft und seinem Umfeld sehr bewundert.
Chambers kehrte in seinen späteren Kurzgeschichtensammlungen The Maker of Moons, The Mystery of Choice und The Tree of Heaven zum unheimlichen Genre zurück, aber keine davon brachte ihm so viel Erfolg ein wie The King in Yellow. Einige von Chambers' Werken enthalten Elemente der Science Fiction, wie z. B. In Search of the Unknown und Police! ! ! , über einen Zoologen, der auf Monster stößt.
Chambers' Hauptwerk der historischen Fiktion war eine Reihe von Romanen, die während des Deutsch-Französischen Krieges spielen. Diese Romane waren The Red Republic (1895, in dessen Mittelpunkt die Pariser Kommune steht), Lorraine (1898), Ashes of Empire (1898) und Maids of Paradise (1903). Chambers schrieb Special Messenger (1909), Ailsa Paige (1910) und Whistling Cat (1932), Romane, die während des amerikanischen Bürgerkriegs spielen. Chambers schrieb auch Cardigan (1901), einen historischen Roman für jüngere Leser, der zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Amerikanischen Revolution spielt. Später wandte sich Chambers dem Schreiben von Liebesromanen zu, um seinen Lebensunterhalt zu verdienen. Einigen Schätzungen zufolge hatte Chambers eine der erfolgreichsten literarischen Karrieren seiner Zeit, seine späteren Romane verkauften sich gut und einige erreichten Bestsellerstatus. Chambers' Liebesromane zeigten oft intime Beziehungen zwischen "katzbuckligen" Männern und sexuell willigen Frauen, was dazu führte, dass einige Rezensenten Chambers' Werke der Förderung der Unmoral beschuldigten. Viele seiner Werke wurden auch in Zeitschriften fortlaufend veröffentlichte.
Sein Roman The Man They Hanged handelte von Kapitän Kidd und vertrat die Ansicht, dass Kidd kein Pirat war, sondern von der britischen Regierung zum Sündenbock gemacht worden war.
Während des Ersten Weltkriegs schrieb Chambers Kriegsabenteuerromane und Kriegsgeschichten, von denen einige eine starke Rückkehr zu seinem alten skurrilen Stil zeigten, wie z. B. "Marooned" in Barbarians (1917). Nach 1924 widmete er sich ausschließlich dem Schreiben historischer Romane.
Chambers lebte mehrere Jahre lang in Broadalbin, New York, seiner Sommerresidenz. Einige seiner Romane handeln vom kolonialen Leben in Broadalbin und Johnstown.
Am 12. Juli 1898 heiratete er Elsa (Elsie) Vaughn Moller (1872-1939). Sie hatten einen Sohn, Robert Edward Stuart Chambers (1899-1955) (der manchmal den Namen Robert Husted Chambers verwendete).
